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* 標題 新竹生醫電子報第109期-CRISPR 在分子診斷上的應用
* 分類 研發人培
* 公告單位 企劃組產學研發科
* 公告日期 2017/08/10
 

作者:財團法人工業技術研究院蔡育庭研究員

 

 

    CRISPR-Cas System Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPR-associated proteins (Cas)」全名為常間回文重複序列叢集/常間回文重複序列叢集關聯蛋白系統,最早在1987年被發現,當時科學家在腸道大腸桿菌發現一段iap基因附近有五段中間各夾著一段獨特隨機序列(稱為spacer)的重複序列,但並不知道其功能為何,直到2002年,科學家們才將這段序列命名為CRISPR,而這些序列都會伴隨著一群特定基因,名為CasCas基因所產生的蛋白質具有核酸內切酶的活性,能切DNA2005年,CRISPR spacer的序列被證實了與病毒的DNA具有高度相似性,到了2007CRISPR/Cas系統被證實是細菌抵禦外來病毒入侵的方式,具有專一性防禦的特性。

    CRISPR/Cas system的防禦機制分為三個階段:

第一階段 Adeptation:

    當細菌遭受外來病毒攻擊時,具有核酸內切酶的Cas會將病毒DNA切斷,並插入細菌本身的基因組中(即上述的Spacer),spacer序列相當於病毒的『感染記錄』,細菌就是用spacer來記憶曾經感染過的病毒。

 

第二階段 crRNA biogenesis:

    病毒在感染後若存活下來,當被相同的病毒再次感染時,細菌就會利用CRISPR轉錄一段特別的RNA,稱為CRISPR RNA(crRNA)

 

第三階段 interference:

    crRNA產生出來後,和Cas蛋白質形成effector complex,細菌則利用crRNA和病毒的DNA比對,若發現其序列與某段spacer相同,表示細菌又被相同病毒感染,complex Cas核酸酶隨即剪斷入侵病毒的DNA,使其失去攻擊細胞的能力。

     CRISPR/Cas system又可分為兩個classclass 1是由多個Cas 蛋白質所組成的多單元(multi-subunit) effector complex,而class 2是由單一Cas蛋白質所組成的effector complex。因為class 2CRISPR/Cas system組成較為簡單、好操作,故最常應用在分子生物學的基因剪輯研究上。也因為在動物、植物、細菌等生物中的基因打靶研究應用了CRISPR/Cas system,成功率比傳統的基因剪輯技術大為提高,而加速了當代的基因研究。

     2016年,張峰(Feng Zhang)團隊發表了在Leptotrichia shahii 細菌中發現了新的CRISPR/Cas systemCas 蛋白質命名為Cas13a,其為Class 2, Type VICRISPR/Cas systemCas13a的特性和常用的Cas蛋白質有所不同,其為RNA引導(RNA-guided)的核酸內切酶,會干擾侵襲的RNA型噬菌體(Phage)。也就是細菌的crRNA與入侵的病毒單股RNA比對若相同,就會啟動Cas13a切斷入侵病毒的RNA,利用這樣的特性,就可以設計來剔除(knock down)特殊的mRNA,進而研究此mRNA相關的功能。Cas13a還有一個特殊的特性,就是除了會切與crRNA相對應的mRNA外,還具有不加選擇的RNase活性(promiscuous RNase activity),也就是會切目標mRNA外其他不相關的RNA,稱為附帶效力(collateral effect)。

    利用附帶效力,張峰團隊設計了帶有螢光的斷裂報告(cleavage reporter) RNA,當reporter被切後,就會發出螢光,偵測螢光就可以來區別及定量標的物。結合Cas13a的附帶效力與單溫放大(isothermal amplification)法,建立了基於CRISPR的診斷法(CRISPR-based diagnostic, CRISPR-Dx)。而這個分子診斷平台,張峰團隊稱之為SHERLOCKSpecific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)。利用這個平台,可以快速的偵測DNARNA達到attomolar(10-18M)的敏感度(sensitivity),與單一鹼基錯誤配對的專一性(single-base mismatch specificity)。

    在感染症病源檢測的測試中,SHERLOCK可以利用分別針對茲卡病毒或登革熱病毒專一設計的crRNA來有效偵測到相對應的病毒,可以偵測茲卡病毒顆粒到2 aM,在真正茲卡病人尿液檢體的檢測中也可以有效的偵測低到1.25 copy number/ul的病毒。而設計相對應不同種細菌間16s rRNA gene V3 regioncrRNA,也可以有效的區分出不同種的細菌。crRNA和標的雙鏈(duplex)有一個特性,在只有一個錯誤配對時,依然可以進行Cas13a RNAse的功能,但是當出現兩個以上的錯誤配對時,就會影響到Cas13a 的功能,利用這樣的特性,設計相對應不同品系(strain)病毒的crRNA,就可以有效區別不同品系的病毒。此外,這樣的特性,也可以用在基因型鑑定的分析。血液中的cell-free DNA充滿大量wild type DNA,用傳統的檢測方式要檢測cell-free 癌細胞突變DNA是很困難的,但是透過SHERLOCK高敏感度的特性,可以在cell-free DNA樣本中偵測到0.1%的突變DNA

    透過張峰團隊的研究,將CRISPR/Cas system從分子生物學基因剪輯的研究上,推展到了臨床分子診斷的應用,不論是在病原體的檢測、基因型鑑定或癌症突變基因的偵測,都提供了一個新的高敏感度與高專一性的新方法。雖然,這只是一個開端,但對未來需要快速、價格低廉、高敏感度核酸檢測的定點照護(Point-of-Care)無疑是一個助益。

 

出處與延伸閱讀:

1.          Abudayyeh et al. (2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573-1-9.

2.          Gootenberg et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438–442.

3.          Hsu Et al. (2014). Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell 157, 1262-1278.

4.          Wright er al. (2016). Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell 164, 29-44.

 
* 截止日期 2027/08/10
 
相關圖檔:
 
圖1.CRISPR為細菌抵禦外來病毒入侵的方式
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