國家科學及技術委員會新竹科學園區管理局

作者:財團法人工業技術研究院生醫與醫材研究所唐嘉英副研究員

1987年日本科學家在大腸桿菌基因組中發現許多重覆的短基因序列，後來陸續於各種細菌及古細菌發現這種相似的短基因序列，稱為CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)，意思為「群聚且有規律間隔的短回文重複序列」。當時科學家對於他的功能與作用機制無太多著墨，直到2005年發現這些細菌中的重覆序列來自於病毒或游離的DNA質體，且CRISPR基因一部份會轉譯為具有切開DNA功能的相關蛋白質複合體─命名為Cas (CRISPR associated)，另一部分的重覆短基因序列則轉錄為具有導航功能的crRNA。後來證實的，當病毒或一些外來DNA入侵細菌時，crRNA會帶著Cas到目標外來DNA，Cas蛋白質進而辨識，最後將外來DNA切除，以達到自我防衛的效果。

目前已發現的CRISPR-Cas依作用機制分為三大類，其中又以2011年所發現的第二大類最為特別，僅需單一蛋白質即可辨識、切開DNA，這項優點使type II CRISPR-Cas能夠做為簡單又有效的基因編輯工具。目前使用最廣泛的就是從化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)所發現的type II CRISPR-Cas9。目前RNA-guided CRISPR-Cas9基因編輯技術作為基礎工具已廣泛應用於動植物及微生物領域研究，初步的結果也顯示其於臨床醫療上之可行性。

2014年Hao Yin等研究人員將患有酪氨酸血症(tyrosinemia)的小鼠利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功修復造成疾病的突變Fah基因，顯示以CRISPR-Cas9進行基因治療之可行性。2016年六月，美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)核准一項為期兩年，對於其他治療無效的血癌、多發性骨髓瘤患者18人進行T細胞基因編輯之免疫療法臨床試驗。此為CRISPR在美國之首次人類臨床試驗。該試驗將由美國賓州大學Carl June所帶領的團隊於2017年執行。研究團隊將病患自身的免疫細胞‑T細胞取出，進行三種改造：讓T細胞表現可辨識癌細胞的T-cell receptor (TCR)、用CRISPR關掉原本的TCR基因、踢除會抑制T細胞活化的PD-1基因，再將改造過的T細胞注回患者體內，期望其可辨識、活化並攻擊癌細胞，達到治療效果。同一年，中國科學家Lu You 也將展開利用CRISPR-Cas9於非小細胞肺癌患者治療之臨床試驗。該試驗對象為現行治療方法皆無效之轉移性非小細胞肺癌患者。該研究團隊之作法與美國相似‑將患者之T 細胞取出，以CRISPR-Cas9將PD-1基因剔除 (knock out)，在體外將T細胞培養數量放大後送回病患體中，令其攻擊癌細胞。

CRISPR除了可將基因關閉，也可進行基因序列修復，可望用於治療基因突變所引發之遺傳性疾病。對於單一基因突變所導致遺傳的疾病如囊腫纖維症(cystic fibrosis)、鐮刀型貧血(sickle-cell anemia)、杜顯氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)等，可透過CRISPR-Cas9矯正突變的基因，使其恢復正常功能。史丹佛大學的Porteus實驗室近期發表一份研究報告，證實可利用CRISPR-Cas9基因編輯技術將鐮刀型貧血患者造血幹細胞中突變的Beta球蛋白 (beta-globin)基因修復。同樣的，雖方法有些微不同，加州大學柏克萊分校也成功的以 CRISPR-Cas9修正β球蛋白基因。Porteus實驗室正準備量產這些以CRISPR-Cas9編輯後的細胞，主要用於治療鐮刀型貧血及嚴重複合型免疫缺乏症(severe combined immune deficiency, SCID)，預計2018年開始進行臨床試驗。除了這些臨床試驗，還有許多疾病可利用CRISPR-Cas基因編輯技術進行治療，如關掉淋巴球CCR5受體基因，可抑制後天免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵染。

目前最新2017年8月發表在國際知名科學期刊《Nature》的一篇研究中，Hong Ma等研究人員利用CRISPR-Cas9成功修復人類胚胎突變基因MYBPC3，該基因突變後會造成一種顯性遺傳性心臟病-肥厚性心肌症(hypertrophic cardiomyopathy)。實驗中58個人類胚胎所帶有的突變基因MYBPC3全部被CRISPR-Cas9切開，而其中42個成功修復成正常胚胎，成功率高達72.4%。進一步分析後結果顯示目前所擔憂的脫靶效應(off-target)並沒有發生，也就是說沒有其他正常的基因被CRISPR-Cas9影響。這項研究結果非常振奮人心，CRISPR-Cas9用於人類臨床基因治療又向前邁進一步。

目前應用CRISPR-Cas基因編輯技術之人類臨床試驗才剛開始，僅管編輯後的基因對於人體長遠影響目前仍不得而知，CRISPR-Cas相較傳統基因編輯技術更容易操作、物種限制低、可廣泛應用於一般分子生物實驗室，且能夠同時進行多個基因編輯等諸多優點，徹底改變且加速了全世界生物學研究方法，更對於未來人類疾病治療更提供全新的方法。

出處與延伸閱讀：

1.          Doudna, J. A. and E. Charpentier. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346 (6213) (2014)

2.          Hsu, P. D. et al. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell 15: 1262-1278 (2014) 

3.          Ma, H. et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. doi:10.1038/nature23305 (2017)

4.          Makarova, K. S. et al. Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems. Nature Reviews 9: 467-477 (2011)

5.          Reardon, S. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel. Nature doi:10.1038/nature.2016.20137 (2016)

6.          Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype (Nature Biotechnology 32, 551–553 (2014))

7.          Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos (Nature 548, 413–419 (24 August 2017))